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本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），專用于定量檢測大鼠下丘腦、垂體、血清中的 TRH 濃度。檢測范圍覆蓋 0.313-20 ng/mL，靈敏度達 0.16 ng/mL，適用于下丘腦 - 垂體 - 甲狀腺軸、能量代謝、體溫調節(jié)及甲狀腺功能研究。

核心原理：

固相化：微孔板預先包被抗大鼠 TRH 抗體。

結合：加入標準品或樣本，TRH 被固相抗體捕獲。

檢測：加入化的抗大鼠 TRH 抗體和 HRP 標記親和素，形成抗體 - 抗原 - 酶標抗體復合物。

顯色：加入 TMB 底物，被 HRP 催化由藍色變?yōu)辄S色。

測定：用酶標儀在 450nm 波長測定吸光度 (OD 值)，濃度與 OD 值成正比。

樣本要求：

1. 樣本類型與處理

血清：無熱源無菌采集，杜絕溶血、脂血污染；1000×g 離心 10 min 分離上清，-20℃分裝保存，嚴禁反復凍融。血漿：選用 EDTA / 檸檬酸鹽 / 肝素抗凝管采血混勻，離心去除血細胞取上清備用（部分試劑盒慎用肝素）。細胞上清：收集后 1000×g 離心 10 min 去除細胞碎片與雜質，-70~-80℃低溫保存。組織勻漿：預冷生理鹽水 / PBS 冰上制備勻漿，高速離心取澄清上清，-20℃避光分裝貯存。

2. 通用注意事項

1) 樣本嚴禁添加疊氮鈉（NaN?），會抑制 HRP 酶活性，導致顯色失效。

2) 所有樣本避免室溫久置，全程低溫操作，防止蛋白降解。

3) 溶血、渾濁、微生物污染樣本直接廢棄，干擾抗體抗原結合。

4) 細胞上清、低豐度指標樣本務必設置復孔，校正實驗誤差。

5) 檢測濃度超標時，僅用試劑盒配套稀釋液稀釋，匹配基質體系。

操作步驟：

1.試劑準備

將試劑盒平衡至室溫（20-25℃），濃縮洗滌液按 1:20 稀釋備用。

標準品按說明書進行梯度稀釋，配制系列濃度標準曲線溶液。

2.實驗流程

加樣：設置空白孔、標準孔、待測樣品孔，空白孔僅加稀釋液，其余孔分別加入標準品或待測樣品，37℃孵育。

加酶標抗體：除空白孔外，每孔加入酶標抗體，輕輕混勻，37℃避光孵育。

洗滌：棄去孔內液體，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后甩干，重復洗滌 4-5 次，最后拍干殘留液體。

顯色：每孔加入 TMB 顯色液，37℃避光孵育，孔內呈現(xiàn)藍色。

終止：每孔加入終止液，混勻后顏色由藍色轉為黃色。

檢測：在 450nm 波長下測定各孔 OD 值，15 分鐘內完成讀數。

3.關鍵提示

實驗全程嚴格控溫，孵育時使用封板膜避免蒸發(fā)。

洗滌需充分，否則易造成高背景、結果偏差。

顯色液需避光，終止順序與加樣順序保持一致，確保充分混勻。

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