本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），專用于定量檢測(cè)大鼠血清、血漿、組織勻漿及細(xì)胞上清液中的 HSP gp96 濃度。檢測(cè)范圍覆蓋 0.313-20 ng/mL，靈敏度達(dá) 0.16 ng/mL，適用于細(xì)胞應(yīng)激保護(hù)、蛋白折疊、腫瘤免疫、抗原遞呈及應(yīng)激損傷研究等領(lǐng)域。
產(chǎn)品名稱 |
大鼠熱休克蛋白糖蛋白96elisa試劑盒 | 英文名稱 | HSP gp96 ELISA Kit |
貨號(hào) | CS-5549E | 規(guī)格 | 48T/96T |
保存 | 避光保存 | 用途 | 僅供科研實(shí)驗(yàn) |
核心原理：
固相化：微孔板預(yù)先包被抗大鼠 HSP gp96 抗體。
結(jié)合：加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣本，HSP gp96 被固相抗體捕獲。
檢測(cè)：加入化的抗大鼠 HSP gp96 抗體和 HRP 標(biāo)記的親和素，形成 "抗體 - 抗原 - 酶標(biāo)抗體" 復(fù)合物。
顯色：加入 TMB 底物，被 HRP 催化由藍(lán)色變?yōu)辄S色。
測(cè)定：用酶標(biāo)儀在 450nm 波長(zhǎng)測(cè)定吸光度 (OD 值)，濃度與 OD 值成正比。
樣本要求：
1. 樣本類型與處理
血清：無(wú)熱源無(wú)菌采集，杜絕溶血、脂血污染；1000×g 離心 10 min 分離上清，-20℃分裝保存，嚴(yán)禁反復(fù)凍融。血漿：選用 EDTA / 檸檬酸鹽 / 肝素抗凝管采血混勻，離心去除血細(xì)胞取上清備用（部分試劑盒慎用肝素）。細(xì)胞上清：收集后 1000×g 離心 10 min 去除細(xì)胞碎片與雜質(zhì)，-70~-80℃低溫保存。組織勻漿：預(yù)冷生理鹽水 / PBS 冰上制備勻漿，高速離心取澄清上清，-20℃避光分裝貯存。
2. 通用注意事項(xiàng)
1) 樣本嚴(yán)禁添加疊氮鈉（NaN?），會(huì)抑制 HRP 酶活性，導(dǎo)致顯色失效。
2) 所有樣本避免室溫久置，全程低溫操作，防止蛋白降解。
3) 溶血、渾濁、微生物污染樣本直接廢棄，干擾抗體抗原結(jié)合。
4) 細(xì)胞上清、低豐度指標(biāo)樣本務(wù)必設(shè)置復(fù)孔，校正實(shí)驗(yàn)誤差。
5) 檢測(cè)濃度超標(biāo)時(shí)，僅用試劑盒配套稀釋液稀釋，匹配基質(zhì)體系。
操作步驟：
1.加樣孵育
每孔精準(zhǔn)加入 100μL 對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品 / 待測(cè)樣本，空白孔加等量；貼封板膜密封微孔板，置于 37℃恒溫孵育箱，避光孵育 90min，保證抗原抗體充分結(jié)合。
2.洗板
輕柔棄去孔內(nèi)液體，吸水紙上快速拍干；每孔加滿洗滌工作液，靜置浸泡 30s，甩干拍凈；重復(fù)洗滌5 次，去除未結(jié)合雜質(zhì)，降低背景值。
3.加酶結(jié)合物孵育
除空白孔外，每孔加入 100μL HRP 標(biāo)記特異性檢測(cè)抗體；輕微水平晃板混勻，重新封板，37℃避光恒溫孵育 60min。
4.二次洗板
重復(fù)上述洗板操作 5 次，嚴(yán)格拍干孔內(nèi)殘留液體，杜絕殘留洗液造成假陽(yáng)性、數(shù)據(jù)偏差。
5.底物顯色
避光條件下，每孔加入 90μL TMB 底物顯色液，輕柔混勻；37℃避光精準(zhǔn)孵育 10~15min，此時(shí)液體逐步顯現(xiàn)藍(lán)色，顯色深淺與待測(cè)物含量正相關(guān)。
6.反應(yīng)終止
嚴(yán)格遵循加樣順序，每孔快速加入 50μL 酸性終止液，輕晃微孔板充分混勻，藍(lán)色即刻轉(zhuǎn)為黃色，終止酶促顯色反應(yīng)。
7.上機(jī)讀數(shù)檢測(cè)
加終止液后15min 內(nèi)，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔 450nm 波長(zhǎng)吸光度（OD 值）；以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)、OD 值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合方程計(jì)算待測(cè)樣本目標(biāo)蛋白濃度。
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