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本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），專用于定量檢測大鼠血清、血漿、細胞及組織勻漿中的 ROS 水平。檢測范圍覆蓋 0.313-20 ng/mL，靈敏度達 0.16 ng/mL，適用于氧化應激評價、自由基損傷、衰老及炎癥氧化相關機制研究等領域。

核心原理：

固相化：微孔板預先包被 ROS 特異性捕獲抗體。

結合：加入標準品或樣本，ROS 被固相抗體捕獲。

檢測：加入化檢測抗體及 HRP 標記親和素，形成復合物。

顯色：加入 TMB 底物，被 HRP 催化由藍色變?yōu)辄S色。

測定：用酶標儀在 450nm 波長測定吸光度 (OD 值)，濃度與 OD 值成正比。

樣本要求：

1. 樣本類型與處理

?血清?：使用無熱原/內毒素試管采集，避免溶血或脂血。1000×g離心10分鐘分離血清，-20℃保存，避免反復凍融。

?血漿?：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝，離心后取上清。

?細胞上清?：1000×g離心10分鐘去除顆粒，-70℃保存。

?組織勻漿?：生理鹽水勻漿后離心取上清，-20℃保存。

2. 注意事項

樣本中禁止添加NaN3，以免抑制HRP活性。

細胞培養(yǎng)上清可能因細胞狀態(tài)等因素導致檢測波動，建議設復孔。

操作步驟：

1.加樣孵育

每孔精準加入 100μL 對應標準品 / 待測樣本，空白孔加等量樣本稀釋液；貼封板膜密封微孔板，置于 37℃恒溫孵育箱，避光孵育 90min，保證抗原抗體充分結合。

2.洗板

輕柔棄去孔內液體，吸水紙上快速拍干；每孔加滿洗滌工作液，靜置浸泡 30s，甩干拍凈；重復洗滌5 次，去除未結合雜質，降低背景值。

3.加酶結合物孵育

除空白孔外，每孔加入 100μL HRP 標記特異性檢測抗體；輕微水平晃板混勻，重新封板，37℃避光恒溫孵育 60min。

4.二次洗板

重復上述洗板操作 5 次，嚴格拍干孔內殘留液體，杜絕殘留洗液造成假陽性、數據偏差。

5.底物顯色

避光條件下，每孔加入 90μL TMB 底物顯色液，輕柔混勻；37℃避光精準孵育 10~15min，此時液體逐步顯現藍色，顯色深淺與待測物含量正相關。

6.反應終止

嚴格遵循加樣順序，每孔快速加入 50μL 酸性終止液，輕晃微孔板充分混勻，藍色即刻轉為黃色，終止酶促顯色反應。

7.上機讀數檢測

加終止液后15min 內，用酶標儀測定各孔 450nm 波長吸光度（OD 值）；以標準品濃度為橫坐標、OD 值為縱坐標繪制標準曲線，擬合方程計算待測樣本目標蛋白濃度。

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