鮑皰疹樣病毒PCR檢測(cè)試劑盒檢測(cè)原理
【中文名稱(chēng)】：鮑皰疹樣病毒PCR檢測(cè)試劑盒
【英文名稱(chēng)】：Abalone Herpeslike Virus(AbHV)PCR
【產(chǎn)品規(guī)格】：96T/48T。
【保存條件】：2-8℃低溫保存
【保質(zhì)期】：6個(gè)月，所有試劑盒均提供批次。
檢測(cè)原理
試劑盒針對(duì)鮑皰疹樣病毒的保守基因序列設(shè)計(jì)特異性引物（熒光定量款搭配專(zhuān)屬熒光探針），通過(guò)PCR擴(kuò)增反應(yīng)特異性放大病毒核酸片段。普通PCR款擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，在551bp目標(biāo)片段位置出現(xiàn)特異性條帶即可判定為陽(yáng)性；熒光定量款可通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增過(guò)程中的熒光信號(hào)，結(jié)合梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)實(shí)現(xiàn)病毒載量絕對(duì)定量。
探針?lè)晒舛縋CR款操作流程
?陽(yáng)性對(duì)照梯度稀釋?：在獨(dú)立的污染防控區(qū)域，用模板稀釋液將1×10?拷貝/μL的陽(yáng)性對(duì)照做10倍梯度稀釋?zhuān)玫?02~10?拷貝/μL共6個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
?反應(yīng)體系配制（20μL體系）?：
每個(gè)反應(yīng)管加入10μL 2×qPCR MagicMix、2μL引物探針混合液、6μL無(wú)酶水、2μL核酸模板
同步設(shè)置PCR陰性對(duì)照（無(wú)酶水為模板）、PCR陽(yáng)性對(duì)照（10?拷貝/μL標(biāo)準(zhǔn)品為模板）
?qPCR擴(kuò)增程序?：95℃預(yù)變性3min；95℃ 10s → 60℃ 30s，共40個(gè)循環(huán)，在60℃階段采集熒光信號(hào)。
結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)
普通PCR：目標(biāo)樣本電泳條帶位置與陽(yáng)性對(duì)照一致，且所有對(duì)照結(jié)果正常，判定為鮑皰疹樣病毒陽(yáng)性；無(wú)對(duì)應(yīng)條帶判定為陰性。
熒光定量PCR：Ct值≤35且擴(kuò)增曲線(xiàn)呈典型S型，陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增，判定為陽(yáng)性；Ct值＞38或無(wú)擴(kuò)增曲線(xiàn)判定為陰性；Ct值35~38之間需重復(fù)復(fù)檢確認(rèn)。
關(guān)鍵注意事項(xiàng)
所有試劑全程-20℃避光保存，避免反復(fù)凍融，融化后需渦旋混勻并瞬時(shí)離心，所有操作在冰上進(jìn)行。
嚴(yán)格分區(qū)操作：試劑配制區(qū)、樣本提取區(qū)、擴(kuò)增檢測(cè)區(qū)物理隔離，全程使用帶濾芯無(wú)核酸酶槍頭，防止氣溶膠交叉污染。
陽(yáng)性對(duì)照必須在獨(dú)立區(qū)域操作，嚴(yán)禁將高濃度陽(yáng)性對(duì)照帶入試劑配制區(qū)和樣本處理區(qū)，避免污染整批試劑。
廢棄反應(yīng)管、槍頭等耗材需經(jīng)121℃高壓滅菌30分鐘后再丟棄，擴(kuò)增產(chǎn)物按實(shí)驗(yàn)室生物安全廢棄物規(guī)范處理。
不同批號(hào)的試劑盒組分禁止混用，封板膜僅限一次性使用，避免交叉污染。
本試劑盒僅用于水產(chǎn)科研與鮑魚(yú)疫病監(jiān)測(cè)，不可用于動(dòng)物臨床診斷或人體相關(guān)檢測(cè)，可特異性檢測(cè)鮑魚(yú)組織、養(yǎng)殖水體等樣本中的鮑皰疹樣病毒（AbHV）核酸，引物經(jīng)過(guò)優(yōu)化無(wú)交叉反應(yīng)，覆蓋普通PCR款與探針?lè)晒舛縋CR款兩種規(guī)格。
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